在单细胞rna测序中，细胞数量过多会导致双细胞比例的增加，但实际情况往往是其他指标表现不佳。例如：
- Estimated Number of Cells：估计检测到的高质量细胞数
- Fraction Reads in Cells：高质量细胞的序列数百分比
- Mean Reads per Cell：每个高质量细胞的平均序列数
- Median Genes per Cell：每个高质量细胞的基因数中值
- Total Genes Detected：所有细胞检测到的基因总数
- Median UMI Counts per Cell：每个高质量细胞的平均UMI数
尽管如此，许多研究者仍然倾向于测序更多的细胞，约1万个细胞左右通常是可以接受的。但如果实验环节出现问题，测序2万个或更多的单细胞可能会带来麻烦。
在《Single-Cell RNA Sequencing of Peripheral Blood Mononuclear Cells From Pediatric Coeliac Disease Patients Suggests Potential Pre-Seroconversion Markers》这篇文章中，单个样品测序了近2万个单细胞，总共分析了19,663个单细胞。然而，通过严格的质量控制步骤，过滤后剩余的细胞数不到1万个，这是一个不错的结果。具体的过滤参数并不严苛，主要是确保每个细胞至少检测到200个基因，这是单细胞转录组数据处理中的常规设置（min.features = 200）。以下是相关代码：
library(Seurat) # https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz ## Load the PBMC dataset pbmc.data
通过这样的过滤，可以看到作者的策略是有效的。下图展示了过滤前后的效果：
对于这篇文章的附件中提供的表达量矩阵，尽管质量略有瑕疵，但进行降维聚类分群和生物学命名时问题不大：
从降维聚类分群图中可以清楚地看到不同免疫细胞的分群。以下是用于定义细胞亚群的代码：
#定义细胞亚群 celltype[celltype$ClusterID %in% c(7,8,12,15),2]='Myeloids' celltype[celltype$ClusterID %in% c(0,1,2,9,10,11),2]='CD4' celltype[celltype$ClusterID %in% c(4,5),2]='CD8' celltype[celltype$ClusterID %in% c(3,6,14),2]='Bcells' celltype[celltype$ClusterID %in% c(13),2]='plasma'
大部分文章都会进一步细分免疫细胞亚群，包括淋巴系（T、B、NK细胞）和髓系（单核、树突、巨噬、粒细胞）两大类。文章通常选择进行大量的差异分析和注释来讲述故事。基础的单细胞转录组数据处理步骤包括：
- 上游分析流程
- 课题多少个样品，测序数据量如何
- 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
- 过滤线粒体核糖体基因
- 去除细胞效应和基因效应
- 单细胞转录组数据的降维聚类分群
- 单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
- 把拿到的亚群进行更细致的分群
- 单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较
最基础的步骤往往是降维聚类分群，参考前面的例子，可以帮助大家掌握单细胞聚类分群注解的基本方法。
